Harvard Inmersión en la realidad del ARN de las células

El nuevo método de detección de ARN altamente sensible, específico y multiplexable avanza en la transcriptómica in situ con potencial para una variedad de aplicaciones biomédicas

(BOSTON) – Las células humanas suelen transcribir la mitad de sus aproximadamente 20.000 genes en moléculas de ARN en un momento dado. Al igual que con las proteínas, la función de esas especies de ARN no solo depende de su abundancia, sino también de su localización precisa dentro del espacio 3D de cada célula.

Ahora, el equipo de Church ha desarrollado un nuevo método de detección de ARN llamado BOLORAMIS (abreviatura de “ B arcoded O ligonucleotides L igated O n R NA A mplified para M ultiplexed y paralela I n S itu análisis”) que supera este problema.

BOLORAMIS permite el diseño y utiliza un nuevo tipo de sonda de ADN que se une directamente a su objetivo de ARN y permite la síntesis directa de un amplicón de ADN con código de barras, que puede visualizarse mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) o secuenciarse in situ.. BOLORAMIS permite el análisis de diferentes clases de ARN con mayor especificidad y sensibilidad que FISSEQ y otros métodos, trabaja en el contexto de células y tejidos y puede ser altamente multiplexado. El estudio se publica en Nucleic Acids Research .

“Con BOLORAMIS hemos resuelto algunos de los retos a los que se enfrentan las tecnologías en el campo de la transcriptómica espacial. Nos brinda una ventaja significativa para comprender el comportamiento de las redes moleculares en procesos normales y patológicos, y para investigar nuevos objetivos de fármacos y desarrollar diagnósticos clínicos en el contexto nativo de tejidos que ahora podemos aprovechar ”, dijo Church, quien es el Líder de la plataforma de Biología Sintética del Instituto Wyss y Profesor de Genética en la Escuela de Medicina de Harvard (HMS) y de Ciencias y Tecnología de la Salud en Harvard y MIT.

harvard inmersión en la realidad del arn de las células

“La fuerza de BOLORAMIS radica en el hecho de que sus sondas optimizadas tienen una huella muy corta en los ARN, y que elimina la necesidad de generar primero una réplica de ADN de moléculas de ARN en un paso de ‘transcriptasa inversa’, que puede producir resultados y es caro ”, dijo el coautor principal Songlei Liu , un estudiante graduado que trabaja en el equipo de Church.

En FISSEQ, todos los ARN se fijan primero en su lugar y luego la secuencia completa de ARN se copia en su secuencia de ADN complementaria (transcripción inversa), que luego se circulariza y amplifica en bolas más grandes de ADN. Estos pueden secuenciarse y visualizarse bajo un microscopio de fluorescencia especializado. “En BOLORAMIS, al omitir este paso de transcripción inversa y amplificar directamente la señal de ARN, reducimos las señales fluorescentes falsas y no específicas”, dijo Liu.

Las sondas BOLORAMIS se unen como un candado firmemente y con alta especificidad a una pequeña secuencia de solo 25 nucleótidos en una molécula de ARN y, por lo tanto, tienen una huella mucho más pequeña que otros métodos de transcriptómica espacial dirigida, lo que mejora la resolución. Además, las sondas contienen secuencias de códigos de barras que asignan un código postal molecular único a cada especie de ARN objetivo. Tras la hibridación de las sondas del candado con código de barras al ARN, se circularizan y amplifican en un pequeño amplicón en la ubicación del ARN objetivo, sin la necesidad de un paso de transcripción inversa. A continuación, el amplicón puede secuenciarse in situ o localizarse con alta sensibilidad utilizando un segundo tipo de sonda, conocida como fluorescente in situ. Sonda de hibridación (FISH), que reconoce los múltiples códigos de barras contenidos en un solo amplicón.

El equipo exploró primero las capacidades cuantitativas de BOLORAMIS en células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) cuantificando los niveles de 77 ARNm que codifican una variedad de factores de transcripción y los de 77 ARN no codificantes con otras funciones en la regulación génica. Si bien BOLORAMIS demostró consistentemente una expresión alta y localizada de ARN que se correlaciona con la “madre” en las células, reveló una baja expresión de ARN que promueve la diferenciación. En una línea de células cancerosas, BOLORAMIS pudo rastrear cuantitativamente la ubicación y los movimientos de un ARN no codificante conocido como MALAT1 que viaja entre dos ubicaciones subcelulares diferentes, el núcleo y el citoplasma. Además,