WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid
eRapid: desarrollo de una plataforma de diagnóstico electroquímico multiplexado desde cero
9 de septiembre de 2021
Los investigadores de Wyss describen su viaje en el desarrollo de la tecnología eRapid para realizar pruebas de diagnóstico rápidas y económicas de múltiples biomarcadores en el punto de atención.
Por Benjamin Boettner
(BOSTON) – En un artículo publicado en la prestigiosa revista Accounts in Chemical Research , el director fundador del Wyss Institute, Donald Ingber , MD, Ph.D., y su equipo de sensores dirigido por el científico senior Pawan Jolly , Ph.D. en la Plataforma de Diagnóstico y Terapéutica Bioinspired del Instituto Wyss, describen el desarrollo y la evolución de su plataforma de sensores electroquímicos basados en afinidad eRapid que está comenzando a aplicarse para permitir diagnósticos versátiles y multiplexados de bajo costo en el punto de atención (POC) para diferentes -detectar enfermedades y trastornos. WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid
Respondiendo a la llamada de diagnósticos POC multiplexados
El diagnóstico preciso de muchas enfermedades, como la sepsis, el infarto de miocardio (IM) y la lesión cerebral traumática (TBI), depende de los resultados de una serie de ensayos de diagnóstico que miden los niveles de múltiples biomarcadores. Si bien todos esos biomarcadores están asociados con la enfermedad, obtener un resultado solo para uno de ellos a menudo no es un indicador suficientemente fuerte de la enfermedad; solo una combinación de múltiples pruebas puede generar la confianza para hacer un diagnóstico inequívoco.
Este problema se agrava aún más cuando se necesita un diagnóstico temprano y oportuno en entornos de POC alejados de los laboratorios clínicos, donde las pruebas de diagnóstico generalmente se realizan y analizan. Idealmente, los trabajadores de la salud e incluso los no profesionales tendrían a su disposición pruebas de diagnóstico de POC simples, robustas y multiplexadas que podrían brindarles resultados rápidos para varios biomarcadores y, por lo tanto, la oportunidad de tomar decisiones significativas y responder más rápidamente con los medidas. Sin embargo, «tales capacidades de diagnóstico aún no existen en entornos clínicos o en el hogar y las pruebas POC del mundo real no solo tendrían que ser ultra confiables sino también fáciles de fabricar a bajo costo», explicó el primer autor Sanjay Timilsina. , Ph.D., que trabaja como becario postdoctoral en el equipo eRapid de Wyss.
En principio, los sensores electroquímicos diseñados para detectar biomoléculas específicas podrían hacer realidad el diagnóstico de POC multiplexado. Los sensores electroquímicos ya se utilizan para detectar gases tóxicos, oxígeno y otras moléculas transportadas por el aire, por ejemplo, alcoholímetros, sensores respiratorios de dióxido de carbono y sensores de monóxido de carbono. Una vez que un gas llega a uno de los electrodos del sensor, llamado electrodo de trabajo, se produce una reacción de oxidación o reducción química según el gas que se va a analizar. Por ejemplo, el oxígeno se reduce a agua, lo que hace que el flujo de electrones se mueva desde el electrodo contador (o de referencia) al electrodo de trabajo y, por lo tanto, crea una corriente eléctrica que se puede medir y es proporcional a la concentración de oxígeno en el electrodo de trabajo. gas.
eRapid: sensores electroquímicos multiplexados para diagnósticos portátiles rápidos, precisos
Una plataforma basada en afinidad resistente a las incrustaciones permite la detección simultánea y económica de múltiples biomarcadores
However, only a few electrochemical sensing methods have been developed for clinical biomarkers with at-home glucose meters for diabetic patients being the best example. Glucose is highly abundant in blood and can be detected with a simple enzyme reaction. It is also a small molecule, which allowed engineers to cover electrodes with semi-permeable membranes that are permeable to glucose but prevent larger molecules from reaching the electrodes. However, most clinically relevant biomarkers, including proteins, are larger in size and cannot be measured using this approach. WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid
Además, caen en el rango de tamaño de muchos “agentes bioincrustantes”, un conglomerado de células, proteínas y otras biomoléculas contenidas en la sangre, plasma, orina y saliva que se adhiere a las superficies de los sensores y las vuelve inútiles. La bioincrustación dificulta el flujo de electrones, provoca corrientes de fondo o ruido electrónico no relacionado con la detección del biomarcador objetivo y puede evitar que el agente de detección de biomarcadores del sensor se una a su objetivo. Por lo tanto, la bioincrustación ha sido un desafío importante para el desarrollo de sensores de diagnóstico electroquímicos.
Un segundo gran desafío para el desarrollo de sistemas de sensores electroquímicos multiplexados con alta afinidad por múltiples biomarcadores es la relativa escasez de agentes de afinidad como los bioreceptores específicos de biomarcadores, como los anticuerpos, que deben usarse en pares para permitir la detección específica de biomarcadores individuales. Además, para la detección en paralelo de múltiples biomarcadores con matrices compuestas por múltiples elementos sensores, los pares de biorreceptores no deben producir señales cruzadas que interfieran con los electrodos de los elementos vecinos.
Resolviendo el problema de la bioincrustación
La base de la plataforma eRapid fue el desarrollo por parte del equipo de una estrategia basada en nanotecnología antiincrustante que podría proteger los sensores electroquímicos de los diversos agentes contaminantes contenidos en la sangre y otros fluidos corporales. En un artículo de Nature Nanotechnology , el equipo informó sobre un recubrimiento simple que creaba una matriz porosa tridimensional en la superficie del sensor que consiste en una red de nanomateriales conductores compuestos por nanocables de oro o nanopartículas de oro que fueron reticulados por el químico glutaraldehído a la biomolécula grande. Albúmina de suero bovino (BSA).
Al resolver el problema de la contaminación biológica, siempre que exista una sonda para una molécula objetivo determinada, eRapid puede detectarla. Estos sensores bioquímicos también se pueden fabricar fácilmente para una amplia variedad de aplicaciones a bajo costo.
PAWAN JOLLY
Estas matrices conductoras mejoraron la transferencia de iones a través de sus nanoporos a la superficie del electrodo, al tiempo que repelen los agentes bioincrustantes. Parte de la repulsión se debe al pequeño tamaño de los poros de la matriz, mientras que las moléculas de BSA reticuladas repelen las proteínas de albúmina que están presentes en una concentración extremadamente alta en la sangre. Como prueba de principio, el equipo demostró que una versión de su biosensor diseñado para unirse a la citoquina inflamatoria interleucina-6, podría detectar con sensibilidad este biomarcador objetivo en suero sanguíneo no procesado y, lo que es más importante, que se conservó casi el 90% de la señal electroquímica. incluso un mes después de que se realizó el ensayo. Esto contrasta con otros recubrimientos que se están explorando para prevenir la bioincrustación, que perdieron sus efectos protectores en unas pocas horas. WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid
“El haber creado esta estrategia antiincrustante fue un cambio de juego para nosotros, ya que demostró que es posible crear superficies antiincrustantes efectivas para sensores electroquímicos de diagnóstico, y marcó el comienzo de un viaje multidisciplinario que atravesó áreas muy diferentes de ingeniería, materiales ciencia, biología molecular y medicina ”, dijo Ingber. «Inmediatamente dio vida a nuestra visión mucho más amplia de una plataforma de diagnóstico completamente nueva con capacidades de detección electroquímica para diversas aplicaciones de enfermedades», dijo Ingber, quien lidera la plataforma de Diagnóstico y Terapéutica Bioinspired, y también es profesor de Biología Vascular Judah Folkman. en la Escuela de Medicina de Harvard y el Hospital de Niños de Boston, y profesor de Bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard (SEAS). WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid WYSS, desarrollo de la tecnología eRapid
Haber creado esta estrategia antiincrustante fue un cambio de juego para nosotros, ya que demostró que es posible crear superficies antiincrustantes efectivas para sensores electroquímicos de diagnóstico, y marcó el comienzo de un viaje multidisciplinario que atravesó áreas muy diferentes de la ingeniería, la ciencia de los materiales. , biología molecular y medicina. Inmediatamente dio vida a nuestra visión mucho más amplia de una plataforma de diagnóstico completamente nueva con capacidades de detección electroquímica para diversas aplicaciones de enfermedades.
Desde un revestimiento antiincrustante hasta una plataforma de sensores versátil
Tras su éxito inicial, el equipo optimizó aún más la composición del revestimiento. Las nanopartículas metálicas, como las nanopartículas de oro en sus recubrimientos originales, pueden oxidar las moléculas contenidas en la sangre y otros fluidos biológicos, lo que puede crear señales de fondo electroquímicas no deseadas o ruido no específico, como lo llaman los ingenieros. Los altos costos de las nanopartículas de oro y los nanocables de oro también obstaculizaron el objetivo de los investigadores de poder fabricar sensores electroquímicos de diagnóstico a bajo costo.
En su segundo estudio, que se publicó en Advanced Functional Materials , superaron estos problemas reemplazando el oro con óxido de grafeno como material conductor en su revestimiento.. De hecho, las nanoflakes de grafeno mejoraron aún más las propiedades antiincrustantes del recubrimiento. La exposición de este sensor electroquímico de próxima generación a suero sanguíneo, plasma o sangre completa durante una hora no afectó sus propiedades eléctricas; e incluso la exposición constante al plasma sanguíneo humano durante nueve semanas solo redujo mínimamente la corriente eléctrica que podían transportar. “La solidez y estabilidad de nuestros sensores también significó que los ensayos de unión de diagnóstico se pueden realizar en el sitio del paciente, y luego los chips se pueden transferir a un laboratorio centralizado donde las señales electroquímicas se pueden medir mucho más tarde, lo que podría ser importante en -configuraciones con recursos ”, dijo Timilsina.
eRapid chip photo
En ese momento, el equipo tomó su tecnología básica eRapid para una primera prueba de manejo en el mundo real. A la luz de la gran brecha en las capacidades de diagnóstico en la pandemia de COVID-19, vieron una oportunidad única y comenzaron a colaborar con un socio comercial en Australia, utilizando la tecnología eRapid para diseñar un ensayo de diagnóstico de COVID-19 específico, que ha avanzado a la primera -Ensayos en humanos con muestras de pacientes realizados en la Universidad de Harvard y una licencia de la tecnología bajo el Marco de Acceso a Tecnología COVID-19 .
Paralelamente, después de haber optimizado su recubrimiento de nanocompuestos, el equipo, en colaboración con la Universidad de Bath, encabezado por el primer autor Uroš Zupančič, Ph.D., que estaba visitando el grupo de Ingber, desarrolló su primer enfoque de multiplexación centrado en el diagnóstico. de sepsis. Esta enfermedad no se puede diagnosticar con rapidez y precisión, y pone al menos a 1,7 millones de adultos que la desarrollan cada año solo en Estados Unidos en riesgo de perder la vida.
Los investigadores aprovecharon las capacidades de multiplexación de su plataforma eRapid para desarrollar sensores de acción paralela con electrodos de trabajo para los tres biomarcadores de sepsis procalcitonina (PCT), proteína C reactiva y patrones asociados a patógenos (PAMP), cuyos niveles aumentan de forma variable en pacientes con sepsis. , y actualmente se determinan con la ayuda de ensayos ELISA específicos. En principio, una molécula de biorreceptor que es específica para uno de los biomarcadores, como un anticuerpo o, en el caso de los PAMP, la proteína de captura de patógenos FcMBL versátil diseñada por el Instituto Wyss.- que puede unirse a más de 120 especies de patógenos y toxinas diferentes, incluidos los patógenos causantes de sepsis más prevalentes, se adhiere al revestimiento de un elemento sensor individual de una matriz de sensores para múltiples biomarcadores. Una vez que el biorreceptor se ha unido a su molécula de biomarcador diana, se añade al complejo un segundo biorreceptor que se une a una parte diferente de la misma molécula de biomarcador y que está enlazado a una enzima (utilizando dos biorreceptores para un biomarcador de forma significativa). aumenta la especificidad del ensayo y permite que se amplifique el evento de unión). Un precipitado formado por la enzima a partir de un sustrato químico se deposita localmente sobre el revestimiento y aumenta la corriente de iones al electrodo de trabajo, lo que permite que el sensor registre un evento de unión química como una señal electrónica.
Los investigadores demostraron que el sensor electroquímico multiplexado producía respuestas dentro del rango clínicamente relevante sin interferencia entre los diferentes elementos sensores aislados. Por lo tanto, un mayor desarrollo clínico de eRapid para mediciones simultáneas de biomarcadores podría proporcionar un ensayo de diagnóstico de sepsis mucho más rápido y preciso que podría usarse en el POC o en los consultorios médicos con el potencial de salvar muchas vidas en el futuro. Con este objetivo y otras aplicaciones de diagnóstico de acción rápida, el equipo acopló una versión de un sensor específico para la sepsis con un sistema de microfluidos que permite automatizar el proceso de diagnóstico, lo que hace que el manejo de futuros dispositivos POC sea mucho más fácil de usar y produciendo resultados consistentemente a partir de muestras de sangre muy pequeñas en un tiempo mucho más corto.
La robustez y estabilidad de nuestros sensores también significó que los ensayos de unión de diagnóstico se pueden realizar en el sitio del paciente, y luego los chips se pueden transferir a un laboratorio centralizado donde las señales electroquímicas se pueden medir mucho más tarde, lo que podría ser importante en configuraciones con recursos.
“Esta velocidad no tenía precedentes en el campo y en la literatura científica, y el progreso que habíamos logrado hasta ahora abrió la tecnología para diseñar diagnósticos POC con tiempos de prueba típicamente requeridos de menos de una hora y aplicaciones a más largo plazo en las que los biomarcadores deben ser monitoreados continuamente. , ”Dijo Jolly. “En ese momento, estábamos seguros de que teníamos una plataforma versátil y robusta que se puede funcionalizar para detectar una amplia gama de analitos, desde moléculas pequeñas, como histamina y cortisol, hasta proteínas y anticuerpos grandes”.
En sensores electroquímicos más recientes generados en la plataforma eRapid, el equipo de Ingber también creó la oportunidad de detectar infarto de miocardio y conmoción cerebral al determinar los niveles de múltiples biomarcadores. Además, en un trabajo adicional inédito realizado en colaboración con los grupos de miembros de la Facultad de Wyss Core James Collins, Ph.D., y David Walt, Ph.D., el equipo de eRapid diseñó sensores electroquímicos para aplicaciones POC específicas de COVID-19 que simultáneamente detectar el ARN del SARS-CoV2 mediante la tecnología CRISPR y los anticuerpos producidos por las personas infectadas.
Optimización de la producción de sensores eRapid
Un atributo importante de una plataforma de diagnóstico es la facilidad, la coherencia y la velocidad con la que se pueden fabricar los dispositivos de prueba y qué tan bien se pueden almacenar sus componentes. En un tercer estudio, que se ha depositado como un artículo en el servidor de preimpresión medRxiv y espera su publicación en una revista científica, los investigadores diseñaron estas características en la plataforma eRapid como otro paso clave en su evolución.
El progreso que habíamos logrado hasta ahora abrió la tecnología al diseño de diagnósticos POC con tiempos de prueba típicamente requeridos de menos de una hora y aplicaciones a más largo plazo en las que los biomarcadores deben monitorearse continuamente. Confiábamos en que teníamos a mano una plataforma versátil y robusta que se puede funcionalizar para detectar una amplia gama de analitos, desde moléculas pequeñas, como histamina y cortisol, hasta proteínas y anticuerpos grandes.
El uso de nanoflakes de grafeno en el revestimiento antiincrustante avanzado del equipo, en principio, es más compatible con la fabricación en masa y el almacenamiento a largo plazo de dispositivos electroquímicos. El uso de grafeno también proporciona una reducción de ~ 99% en los costos del material en comparación con los nanocables de oro de primera generación y los recubrimientos a base de partículas de oro. Inicialmente, el recubrimiento tardó aproximadamente 24 horas en asentarse en los sensores eRapid; sin embargo, con un ‘método de recubrimiento por inmersión’ mucho más simplificado desarrollado por el equipo, ahora pueden completar el proceso de recubrimiento en menos de un minuto. “El enfoque también se puede utilizar con mezclas de revestimiento preensambladas después de haber estado almacenadas durante al menos cinco meses a temperatura ambiente, que mantienen más del 85% de los niveles de respuesta electroquímica originales,
Fabricating eRapid sensors using the new dip coating method allowed the bioengineers to produce their sensors for the electrochemical detection of multiple biomarkers of myocardial infarction and brain concussion with unprecedented sensitivity and selectivity. “This new rapid and straightforward method really opens the door for commercial mass-manufacturing of electrochemical sensors with high efficiency antifouling coatings for multiplexed POC diagnostic applications,” said Jolly.
From solving the biofouling problem for electrochemical diagnostic sensors onwards, the eRapid electrochemical sensor technology has been advanced step-by-crucial step by the team approaching their vision of a mature diagnostic platform that is ready to tackle numerous real-world medical challenges.
El artículo de Accounts in Chemical Research también fue escrito por los investigadores de Wyss, Nolan Durr y Mohamed Yafia. El proyecto eRapid fue financiado por el Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard, la Agencia de Proyectos de Investigación de la Agencia de Defensa (DARPA), la Fundación KeepSmilin4Abbie y una beca postdoctoral del Fonds de recherche du Québec.