El nuevo diagnóstico portátil detecta el ARN y los anticuerpos del SARS-CoV-2 al mismo tiempo
8 de agosto de 2022
La nueva plataforma multiplexada combina CRISPR con detección electroquímica para rastrear el curso de las infecciones a través de la saliva
Por Lindsay Brownell
(BOSTON) — A medida que la pandemia de COVID-19 ha seguido su curso, las preguntas que nos hemos estado haciendo han evolucionado: de «¿Cómo sé si estoy infectado?» a «¿Qué tan fuerte es mi inmunidad?» a «¿Qué cepa del virus tengo?» Y, a medida que surgen nuevas variantes, es probable que sigamos haciéndonos esas preguntas, a menudo al mismo tiempo.
Ahora, existe una manera de obtener respuestas para todas ellas en un par de horas, sin necesidad de enviar muestras a un laboratorio. Un nuevo dispositivo de diagnóstico en el punto de atención creado por miembros del Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en la Universidad de Harvard combina las tecnologías eRapid y SHERLOCK del Instituto en un solo sistema del tamaño de una postal que puede detectar simultáneamente la presencia de SARS-CoV- 2 ARN y anticuerpos contra el virus en la saliva de un paciente, y potencialmente muchos otros biomarcadores.
«Este diagnóstico puede permitir un monitoreo multiplexado más económico de la infección y la inmunidad en las poblaciones a lo largo del tiempo, a niveles de precisión que son comparables a las costosas pruebas de laboratorio», dijo la coautora principal Devora Najjar, estudiante graduada en MIT Media Lab y Wyss Instituto. “Este enfoque podría mejorar drásticamente la respuesta global a futuras pandemias y también proporcionar información sobre qué tratamiento deberían recibir las personas”.
El dispositivo prototipo se describe en un nuevo artículo publicado en Nature Biomedical Engineering .
Nueva química para un nuevo virus
James J Collins
El diagnóstico nació de una colaboración entre los laboratorios de los miembros de la facultad de Wyss Core, Jim Collins , Ph.D., y Don Ingber , MD, Ph.D., quien también es el Director Fundador del Instituto.
Donald E Ingber MD Ph D
El equipo de eRapid dirigido por Ingber y Wyss Senior Staff Scientist Pawan Jolly , Ph.D., junto con el equipo de SHERLOCK dirigido por Collins y Helena de Puig, Ph.D., miembro postdoctoral de Wyss, reconoció que, si bien los diagnósticos basados en SHERLOCK pueden detectar moléculas con una sensibilidad exquisita, estaban inherentemente limitados por su sistema de lectura basado en fluorescencia.
Helena de Puig Guixe
Pawan Jolly Ph D
Si pudieran encontrar una manera de traducir la detección molecular de un sistema basado en CRISPR como SHERLOCK en una señal electroquímica como la producida por eRapid, podrían crear un diagnóstico con precisión de nivel de laboratorio que podría usarse en un entorno que no sea de laboratorio. . Comenzaron a construir este dispositivo híbrido y eligieron la enfermedad de Lyme como su aplicación objetivo. En unos pocos meses, habían conseguido que funcionara.
Entonces llegó la pandemia de COVID-19.
“En los primeros días, todos trabajaban en el desarrollo de diagnósticos que pudieran detectar el virus SARS-CoV-2 o los anticuerpos contra él, pero no ambos. Sabíamos que podíamos detectar con éxito la presencia de moléculas de ADN y ARN electroquímicamente, gracias a nuestro trabajo sobre la enfermedad de Lyme. Decidimos descubrir cómo multiplexar eso con la detección de anticuerpos para crear una prueba todo en uno para ayudar a rastrear infecciones y combatir la pandemia”, dijo de Puig, coautor del artículo.
Pero crear una plataforma que pudiera integrar la detección de ARN viral y proteínas humanas fue un desafío. El equipo tuvo que descubrir cómo realizar dos tipos de reacciones moleculares separadas y muy diferentes simultáneamente, y luego integrarlas en un sistema de informes para que los resultados pudieran leerse al mismo tiempo.
Eligieron la saliva como material de muestra, porque allí se pueden encontrar partículas virales y anticuerpos. Para la parte SHERLOCK del diagnóstico, que detecta la presencia de ARN del SARS-CoV-2, el dispositivo debía poder extraer, concentrar y amplificar el ARN viral de una muestra de saliva, luego mezclarlo con reactivos CRISPR y entregar el resultado. solución a la parte del chip eRapid para la detección.
El equipo diseñó un sistema de microfluidos que consta de múltiples depósitos, canales y elementos calefactores para mezclar y transferir automáticamente sustancias dentro del dispositivo prototipo sin necesidad de la intervención de un usuario. En la primera cámara, la saliva se combina con una enzima que rompe las envolturas externas de los virus para exponer su ARN. Luego, la muestra se bombea a una cámara de reacción, donde se calienta y se mezcla con reactivos de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que amplifican el ARN viral. Después de 30 minutos de amplificación, se agrega a la cámara una mezcla que contiene reactivos SHERLOCK y luego la muestra se bombea a un electrodo eRapid.
En ausencia de material genético del SARS-CoV-2 en la mezcla, las moléculas monocatenarias (ssDNA) con biotina unida a ellas se unen a una molécula llamada ácido nucleico peptídico (PNA) en la superficie del electrodo. Luego, la biotina se une a otra molécula en la mezcla llamada poli-HRP-estreptavidina, lo que hace que una tercera molécula, la tetrametilbencidina (TMB), se precipite de la solución líquida como un sólido. Cuando el TMB sólido cae sobre el electrodo, cambia su conductividad eléctrica. Este cambio se detecta como una diferencia en la cantidad de corriente eléctrica que fluye a través del electrodo, lo que indica que la muestra está libre de virus.
Sin embargo, si hay material genético del SARS-CoV-2 presente en la muestra de saliva, la enzima CRISPR dentro de la mezcla de SHERLOCK lo corta tan bien como el ssDNA. Esta acción de corte separa la molécula de biotina del ssDNA, de modo que cuando el ssDNA se une al PNA, no desencadena la serie de reacciones que hacen que el TMB se precipite en el electrodo. Por lo tanto, la conductividad del electrodo no cambia, lo que indica un resultado positivo de la prueba.
“La integración del ensayo basado en PNA con la reacción química de poli-HRP-estreptavidina/TMB que creamos para este dispositivo nos permitió detectar la presencia de SARS-CoV-2 con una sensibilidad cuatro veces mayor que nuestro SHERLOCK original basado en fluorescencia. y produjo resultados en aproximadamente la misma cantidad de tiempo”, dijo el coautor Joshua Rainbow, Ph.D., exestudiante de posgrado visitante en el Instituto Wyss y ahora estudiante de doctorado en la Universidad de Bath. “También fue capaz de detectar la presencia de ARN viral con un 100 % de precisión”.
Mayor que la suma de sus partes
Paralelamente, el equipo personalizó los tres electrodos eRapid restantes colocándolos con diferentes antígenos relacionados con COVID contra los cuales los pacientes pueden desarrollar anticuerpos: la subunidad S1 de la proteína Spike (S1), el dominio de unión ribosomal dentro de esa subunidad (S1-RBD) , y la proteína N, que está presente en la mayoría de los coronavirus (N). Si la muestra de saliva de un paciente contiene uno o más de estos anticuerpos, se unen a sus antígenos asociados en los electrodos. Un anticuerpo secundario que se une a la biotina luego se unirá al anticuerpo objetivo, desencadenando la misma reacción de poli-HRP-estreptavidina/TMB y provocando un cambio en la conductividad del electrodo.
Los investigadores probaron estos sensores específicos de anticuerpos utilizando muestras de plasma humano de pacientes que previamente habían dado positivo por SARS-CoV-2. El sistema pudo distinguir entre anticuerpos contra S1, S1-RBD y N con más del 95 % de precisión.
“Ser capaz de distinguir fácilmente entre diferentes tipos de anticuerpos es muy beneficioso para determinar si la inmunidad de los pacientes se debe a las vacunas o a la infección, y rastrear la fuerza de esos diferentes niveles de inmunidad a lo largo del tiempo”, dijo Sanjay Sharma Timilsina, Ph.D., ex becario postdoctoral en el Instituto Wyss que ahora es científico principal en Stata DX . “La integración de eso con la detección de ARN viral en una plataforma de diagnóstico portátil y multiplexado proporciona una visión integral de la salud de un paciente durante y después de una infección, lo cual es esencial para implementar políticas públicas y estrategias de vacunación”. Stata DX comercializa eRapid para aplicaciones neurológicas, cardiovasculares y renales.
Finalmente, el equipo probó los electrodos de anticuerpos y ARN viral combinados utilizando saliva de pacientes con SARS-CoV-2. Dividieron la saliva en dos porciones, agregando una porción al reservorio de anticuerpos y la segunda porción al reservorio de ARN del dispositivo. Después de dos horas, midieron las lecturas de los electrodos para ver si habían registrado correctamente la presencia de anticuerpos y ARN.
El equipo descubrió que los chips multiplexados identificaron correctamente las muestras de anticuerpos y ARN positivos y negativos con una precisión del 100 % al mismo tiempo. También era ultrasensible, capaz de detectar la presencia de ARN hasta 0,8 copias por microlitro.
“Actualmente, faltan plataformas de diagnóstico de bajo costo que puedan permitir la detección precisa de múltiples clases de moléculas sin necesidad de ir a un laboratorio. Nuestro sistema ofrece lo mejor de ambos mundos: alta precisión y bajo costo en una plataforma multiplexada, y podría brindar mucho valor tanto a los pacientes como a los médicos en el punto de atención. Además, se adapta fácilmente a una amplia gama de aplicaciones”, dijo el coautor Jolly.
El diseño compacto y de bajo costo del dispositivo prototipo es fácil de usar y minimiza la cantidad de pasos que un paciente debe realizar, lo que reduce la posibilidad de error del usuario. Los cartuchos personalizados podrían fabricarse fácilmente para detectar antígenos y anticuerpos de diferentes enfermedades, y podrían colocarse en una carcasa reutilizable y un dispositivo de lectura que el usuario mantendría en su hogar.
Lo que me emociona de este dispositivo de diagnóstico es que combina un alto nivel de precisión con un diseño flexible que podría convertirlo en una herramienta importante en nuestro arsenal para abordar futuras pandemias.
«Lo que me emociona de este dispositivo de diagnóstico es que combina un alto nivel de precisión con un diseño flexible que podría convertirlo en una herramienta importante en nuestro arsenal para abordar futuras pandemias», dijo el coautor principal Collins, quien también es profesor de Termeer. de Ingeniería y Ciencias Médicas del MIT. Además, Collins es cofundador de Sherlock Biosciences , que está desarrollando la tecnología SHERLOCK del Instituto Wyss en diagnósticos para COVID-19.
“Estoy muy orgulloso de estos equipos por unirse durante una crisis global que paralizó la mayor parte de la actividad y por crear algo nuevo y útil que ofrece una gran promesa para el diagnóstico y el manejo en el punto de atención de una amplia gama de enfermedades en todo el mundo. mundo”, dijo el coautor principal Ingber, quien también es profesor Judah Folkman de Biología Vascular en la Escuela de Medicina de Harvard y el Hospital Infantil de Boston, así como profesor Hansjörg Wyss de Ingeniería Bioinspirada en la Escuela de Ingeniería John A. Paulson de Harvard. y Ciencias Aplicadas.
Otros autores del artículo incluyen a Mohamed Yafia, Nolan Durr y Hani Sallum del Instituto Wyss; Galit Alter del Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard; Jonathan Li del Brigham and Women’s Hospital (BWH), Xu Yu del Instituto Ragon y BWH, David Walt del Instituto Wyss, HMS y BWH; Joseph Paradiso del MIT Media Lab y Pedro Estrela de la Universidad de Bath.
Esta investigación fue apoyada por el Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en la Universidad de Harvard, el Grupo de Fronteras Paul G. Allen, el Consejo de Investigación del Medio Ambiente Natural del Reino Unido (NERC) GW4 FRESH CDT, el Fonds de recherche du Québec nature et technologie, la Sra. Enid Schwartz, la Fundación Mark and Lisa Schwartz, el Consorcio de Massachusetts para la Preparación para Patógenos, el Instituto Ragon y el Centro de Investigación del SIDA de la Universidad de Harvard.
- TECNOLOGÍA WYSS – eRapid: sensores electroquímicos multiplexados para diagnósticos rápidos, precisos y portátiles
- PUBLICACIÓN – Nature Biomedical Engineering : un laboratorio en un chip para la detección electroquímica simultánea de ARN del SARS-CoV-2 y anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en saliva y plasma
Primer virólogo en compartir con todo el mundo el genoma del SARS-CoV-2.